Часть города Уфы, отделённая от уфимской крепости рекой Сутолокой, уже в XVII веке по какой-то причине стали называть Старой Уфой. Район нынешней улицы Московской ещё в XVI веке облюбовали для жительства стрельцы и пушкари, присланные для охраны уфимского кремля. Своим святым покровителем пушкари считали преподобного Сергия Радонежского – одного из самых почитаемых русских святых. Ему посвящено большое количество храмов (престолов) – около шестисот по всей России. Только в Москве в честь преподобного Сергия Радонежского выстроено 67 храмов и часовен.

В Уфе деревянный однопрестольный храм в честь преподобного Сергия Радонежского был построен в 1868 году на месте древней церкви, основанной московскими стрельцами. Приход церкви составляли главным образом стрельцы из числа пушкарей. Именно поэтому историк К.П. Херувимов считал, что первоначальную церковь на этом месте возвели прибывшие из Москвы стрельцы и пушкари из «особого уважения их к сему святому, который с древних времен считается на Руси покровителем артиллерии, а также потому, что преподобный Сергий считался небесным покровителем Москвы». Краевед А.А. Пекер считал, что церковь построена бывшими жителями подмосковного Сергиева посада в память о покинутых родных местах, а П.Ф. Ищериков утверждал, что церковь основали монахи сгоревшего уфимского Сергиевского монастыря.

Приход храма состоял из жителей Старой Уфы и Золотухи – всего к началу XX века 1692 душ, в том числе 22 раскольника. Достопримечательностью церкви являлась древняя икона Святого Сергия Радонежского, именно ею был благословлен в Уфе адмирал Колчак в мае 1919 года. На колокольне Сергиевской церкви было шесть колоколов, самый большой из которых весил 81 пуд 38 фунтов.

Иконостас в лучших традициях церковного искусства выполнен в 1894 году резчиком Трапезниковым, деньги на него пожертвовал купец Фёдор Чижов. Много труда положил на строительство и украшение церкви местный протоиерей Фёдор Троицкий, писавший для неё иконы, золотивший иконостас и киоты икон. Он был настоятелем Сергиевской церкви до 1884 года. Тёплые воспоминания о Фёдоре Троицком оставил уроженец Уфы художник Михаил Нестеров.

Прилегающие к церкви улицы имели соответствующие названия – Большая и Малая Сергиевские (соответственно, Менделееева и Бехтерева) и два Сергиевских переулка.

К Сергиевскому храму была приписана и кладбищенская Преображенская церковь, в связи с чем за православным кладбищем Старой Уфы прочно закрепилось название Сергиевское. В 1933 году, после закрытия Воскресенского кафедрального собора, Никольской и Симеоновской церкви, выполнявших поочередно функции собора, Сергиевская церковь стала называться кафедральным собором. В 1937 г. весь причт церкви во главе с епископом Григорием был арестован. В течение нескольких лет храм стоял открытым, но служба не велась. За ним присматривали церковные сторожи и уборщицы. Служба возобновилась в 1942 году. 3 июня 1944 года на имя архиепископа уфимского Стефана была получена телеграмма И.В. Сталина с просьбой передать привет и благодарность верующим Сергиевской церкви, собравшим 200 тысяч рублей в фонд Обороны СССР и 140 тысяч на подарки воинам.

В 1945 г. всему духовенству и верующим Сергиевской церкви была вынесена благодарность командованием госпиталя № 4018 за переданные средства, подарки и помощь раненым. В 1946-м весь причт церкви награжден медалями «За доблестный труд в Великой Отечественной войне 1941 – 1945 гг.». Только за 1945 год приходом было пожертвовано 919 500 рублей.

В 1945 – 1982 гг. в храме служил Моисей Чигвинцев, обладавший дарами прозорливости, предвидения и исцеления по молитве и ныне канонизированный Русской православной церковью в лике преподобного. Мощи его ныне пребывают в стенах храма.

За последние годы внешний облик храма заметно изменился, прежде всего по причине покрытия куполов сплавом «под золото». Долгие годы церковь была окрашена в синий цвет, сейчас она выкрашена значительно более светлой зеленовато-бирюзовой краской.